Анализы на болезнь легионеров

Legionella pneumophila – возбудитель болезни легионеров, одной из форм легионеллёза. L. pneumophila обитает в пресноводных водоёмах на территории России и Европы и внутри водопроводных труб. Заболевание развивается при попадании в дыхательные путиводного аэрозоля, инфицированного возбудителем, протекает с развитием легионеллёзной пневмонии.

ПЦР анализ на болезнь легионеров Начальный период заболевания характеризуется подъёмом температуры до 39-40 °С, возникают головные, мышечные и суставные боли, сухой кашель, одышка. Стадия лихорадки длится 10-15 дней. У четверти пациентов проявляется тошнотой, рвотой, диареей, а также острой дыхательной недостаточностью. У большинства больных наблюдают патологическое увеличение печени. В тяжелых случаях нарушается сознание, возникает дезориентация. Вторично поражается почечная ткань.

Своевременная диагностика и эффективная этиотропная терапия определяют вероятность летального исхода, она составляет 8-40%. Легионеллы абсолютно нечувствительны к пенициллину и цефалоспоринам, высокочувствительны к макролидам (максимально эффективен эритромицин), чувствительны также к фторхинолонам (ципрофлоксацин).У 80% больных выявляют L. pneumophila серогруппы 1, у остальных может быть обнаружена L. pneumophila других серогрупп. При пониженном иммунитете заболевание может вызываться другими видами Legionella.

Характеристика исследования:

Тип биоматериала: слизь из нижних дыхательных путей.
Синонимы (rus): бактерии легионеллы, болезнь легионеров
Синонимы (eng): legionella pneumophila, legionella bacteria
Метод исследования: полимеразная цепная реакция.
Сроки выполнения: 3 дня

ПЦР, или полимеразная цепная реакция – это молекулярно-генетический метод диагностики заболеваний, суть которого заключается в обнаружении ДНК возбудителя в исследуемом материале. Поиск ДНК Legionella pneumophila методом ПЦР применяется при условии:

наличия материала из гортани, трахеи, бронхов;
подозрения на заболевание, вызванное L.pneumophila серогруппы, отличной от 1-й;
летального исхода от пневмонии, происхождение которой не было установлено.

Легионеллёз относится к тяжёлым инфекционным заболеваниям, возникающим на фоне попадания в организм бактерии легионеллы. Как правило, этот патоген активно развивается и растёт в увлажнённой среде (в частности в системах воздушного кондиционирования, ингаляторах, в условиях замкнутого цикла циркуляции воды). Заболевание, спровоцированное патогенном Legionella, впервые было выявлено и описано в 1976 году на фоне сильной вспышки летальной пневмонии, распространившейся в период проведения международной конференции в штате Пенсильвания. На ней присутствовали легионы из Америки, потому инфекция получила название «легионеллёз». Согласно статистике, 75-80 % инфицированных – взрослые пациенты старше 50 лет, из них 60-70 % – представители мужского пола.

Самые распространённые пути заражения Legionella – аэрозольный и воздушно-капельный при вдыхании инфицированных аэрозолей, формирующихся путём водного распыления, образования тумана либо струи. Проникнуть в организм человека инфекция может и вследствие аспирации заряженных кристаллов льда и воды, в частности у пациентов со слабым здоровьем, проходящих лечение в стационаре медучреждений. Время инкубации заболевания длится от 2-х до 10-ти суток (при ряде диагностированных вспышек оно может затягиваться до двух недель). Летальный исход наблюдается при прогрессивной форме воспаления лёгких с расстройством либо асфиксией, а также при полиорганной недостаточности. При отсутствии надлежащего лечения в первую неделю заражения Legionella происходит резкое ухудшение состояния здоровья.

Прогрессирование инфекции варьируется в зависимости от степени тяжести протекания болезни. Среди больных встречаются как случаи с лёгким лихорадочным состоянием, так и с тяжёлой формой смертельной пневмонии. Последние возникают и развиваются на фоне проникновения в организм бактерии из почвы и воды. Случаи инфицирования Legionella pneumophila классифицируются согласно разновидности её воздействия на организм (заражение при контакте в обществе, в период посещения других стран с туристической целью, в больнице).

Часто диагностируемой причиной болезни, в т. ч. вспышки, является сам патоген легионеллы. Этот возбудитель, как и связанные с ним другие разновидности, обитает в водоёмах, почве. Для легионеллёза характерны: поражение ЦНС, дыхательных путей, органов выделения, общая интоксикация. При наличии у больного низкого иммунитета, сахарного диабета, хронических форм пневмонии риск заражения легионеллёзной инфекцией многократно возрастает.

Медицинская значимость анализа

Исследование фаринго-трахеальной мокроты проводится методом ПЦР, который позволяет увеличить число ДНК возбудителя с целью лёгкого его обнаружения. В его основе лежит многочисленный рост копий-фрагментов ДНК, характерных для Legionella pneumophila.

Анализ успешно применяется при:

диагностике пневмонии в совокупности с показателями повышенного риска инфицирования;
комплексном обследовании на легионеллёз.

Тест ПЦР идеально подходит для определения возбудителя Legionella, так как в условиях стандартных сред он не размножается. Используя его, можно идентифицировать факты носительства, а также прогрессирование инфекции в период острой фазы заболевания.

ПЦР-диагностика индуцированного секрета ценна при детекции инфекций нижнего отдела дыхательных путей. Когда у пациента невозможно получить аспират для анализа, в решении относительно дальнейшей терапии нужно руководствоваться полом, возрастом человека, наличием / отсутствием факторов риска, а также наиболее распространённой формой болезни.

Важно! Качественные ПЦР-системы для выявления бактерии легионеллёза должны быть одобренными ВОЗ и официально зарегистрированными, а медицинские центры, которые с ними работают, – аккредитованными.

Требования к сбору индуцированной мокроты из лёгких

При диагностике легионеллёза анализируется выделяемая из лёгких мокрота. Чтобы собрать качественный материал, необходимо следовать следующим правилам:

Забор секрета производится в утренние часы на голодный желудок. Мокрота собирается в стерильную баночку с крышечкой. Такую ёмкость можно купить в аптеке или получить заблаговременно в лабораторном центре.
В момент очередного откашливания отхаркнуть лёгочный секрет в ёмкость, после чего плотно закрыть крышкой. Хранить баночку открытой нельзя, т. к. в биоматериал может попасть инфекция извне, что приведёт к недостоверному результату.
Сразу же после сбора секрет следует как можно быстрее доставить в лабораторию для исследования.
В случае когда у человека затруднено откашливание лёгочного секрета, для разжижения мокроты и облегчения его выхода предварительно нужно выпить муколитический препарат.

Выделение ДНК (РНК) из исследуемого материала

При болезни легионеров на исследование берётся слизь из нижних дыхательных путей. На материал, содержащий клетки искомого возбудителя, оказывается воздействие поверхностно-активными веществами или высокой температурой, так как необходимо разрушить клеточную мембрану. После лизиса ДНК отделяют от прочих клеточных элементов.

Правила забора фаринго-трахеального секрета на исследование

Для проведения диагностики фаринго-трахеального аспирата с помощью ПЦР потребуется утренний сбор мокроты. Её отбирают в специальный контейнер с плотно фиксирующейся крышкой в диагностическом центре. Главная задача – получение непосредственно мокроты, а не слизи / слюны.

Перед забором биоматериала нужно нормализовать дыхание, чтобы лёгкие наполнились воздухом. Для этого человеку рекомендуется сесть, слегка опустить плечи. Важно сделать глубокий вдох, задержать на несколько секунд дыхание, затем глубоко выдохнуть воздух из лёгких. Выполнить 5 таких вдохов. Сделать в течение суток накануне дня проведения процедуры 2-3 подхода.

Взятие образца аспирата из нижнего отдела дыхательных путей происходит через 2-4 часа с момента последнего употребления пищи. Непосредственно перед исследованием (за 1 час до диагностики) пациенту следует воздержаться от курения, очищения ротовой полости и зубов. За 6 часов до манипуляции запрещено орошать полость рта лекарственными, дезинфицирующими спреями, рассасывать пастилки, закапывать в нос и горло аэрозоли, капли.

Перед забором на анализ аспирата прополоскать ротовую полость тёплой кипячёной водой. В случае когда нос заполнен слизью, перед процедурой следует высморкаться.

Из образцов фаринго-трахеального аспирата, полученных из нижнего отдела дыхательных путей, изначально в лабораторных условиях создают окрашенный по Грамму препарат. При содержании в нём менее десяти полиморфонуклеарных лейкоцитов и более десяти плоских эпителиальных клеток такой секрет классифицируется как слюна, вследствие чего материал не подлежит молекулярно-биологическому исследованию.

Обратите внимание! Так как получение мокроты отхаркиванием у младенцев, новорожденных, детей до 6 лет невозможно, биоматериал для исследования у них получают из верхнего отдела дыхательных путей. Диагностика анаэробных бактерий в таком секрете не проводится, поскольку исследуемый образец контаминирован анаэробами катара дыхательных путей, являющимися частью их естественной микрофлоры.

Амплификация (умножение) участков ДНК

Выделенные фрагменты ДНК помещают в пробирку и добавляют реактивы. Далее пробирку отправляют в амплификатор – прибор, способный циклически поддерживать перепады температур. В результате температурного воздействия двухцепочечная молекула ДНК разделяется.При участии фермента ДНК-полимеразы и специфических нуклеотидных последовательностей (праймеров) идёт достраивание новых фрагментов ДНК. Этот процесс носит название элонгации. Удлинение молекулы ДНК идёт по принципу комплементарности.

Полимеразная цепная реакция заключается в том, что полученные цепи ДНК становятся матрицей для синтеза фрагментов нуклеиновых кислот в новом цикле. После 30-40 циклов амплификации образуется столько молекул ДНК, что их можно наблюдать визуально с помощью флюоресцентного красителя.

Специфичность ПЦР-диагностики

Анализ эффективности разных методик тестирования представляет собой сложную задачу, т. к. нет единого стандарта диагностики Legionella pneumophila. Популярный BinaxNOW®UAT обнаруживает лишь вид 1-ой серогруппы L. pneumophila, тогда как культуральный тест не используется по причине низкой резистентности.

Метод ПЦР отличается высокой чувствительностью. В отличие от бактериологического анализа этот тип исследования способствует ускорению диагностирования легионеллёзной пневмонии на 3-4 дня. Он даёт возможность найти в анализируемом материале фрагмент ДНК возбудителя, а также выявить поодинокие молекулы бактерии Legionella, которые невозможно обнаружить с помощью других способов. Чувствительность и быстрота исследования позволяют диагностировать различные виды Legionella в образцах из экологических и клинических источников.

Восприимчивость теста ПЦР в сравнении с культуральными методами составляет 100 %. В то же время, как и культуральный метод, ПЦР может обнаруживать все серогруппы легионеллы.

Визуализация продуктов ПЦР

Для обнаружения полученных нуклеиновых кислот проводят агарозный гель-электрофорез. В геле содержится краситель – бромидэтидия, который связывается с ДНК и флюоресцирует в УФ-лучах. В результате на уровне искомой ДНК будет видна оранжевая полоска.

Обнаружение ДНК легионеллы методом ПЦР говорит о присутствии возбудителя в организме, но диагноз принято считать предположительно верным. Достоверность полимеразной цепной реакции составляет от 95% до 100%, однако отсутствие искомого ДНК в исследуемом материале не исключает наличие инфекции.

Насколько достоверный анализ?

Отсутствие деления генетического материала возбудителя в тестируемой пробе не всегда свидетельствует об отсутствии патогена. Иногда встречаются и ложные результаты.

Среди основных причин присутствия бактерии Legionella в человеческом организме выделяют: предшествующую исследованию антибактериальную терапию, наличие паразитов, вирусов, грибов, микобактерий, посторонних загрязнений в диагностируемом образце. В 40-60 % случаях заражения нижнего отдела дыхательных путей инфекция остаётся не выявленной.

Неправдивый результат ПЦР на определение ДНК легионеллы может быть получен в результате загрязнённых реагентов.